رنـگ‌آمیـزی گـرم از گونــه‌ی میـکروکوکـ (Micrococcus sp)

 ایـن ارگانیسـم‌ها به‌صورت میکروسـکپی از استافیلوکوک‌ها بزرگ‌تر بوده و غالباً به فرم چهارتایی (تتراد) می‌باشند.

رنگ‌آمیزی گرم از استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (S.epidermidis)، کوکســی گرم مثبت

کلنی دایره‌ای شکل و زرد رنگ از استافیلوکوکوس اورئوس (S.aureus)، بر روی محیط تریپتی کاز سوی آگار

آزمایش حساسیت به باسیتراسین، برای افتراق گونه‌های میکروکوک از گونه‌های استافیلوکوک به کار می‌رود. در این آزمایش از دیسک باسیتراسین (0.04U) استفاده می‌شود. بعد از اینکه باکتری را بر روی محیط مولر هینتون آگار کشت داده دیسک حاوی باسیتراسین را بر روی محیط گذاشته و به مدت یک شب انکوبه می‌کنند، در صورتیکه قطر هاله عدم رشد ۱۰ میلی متر یا بیشتر باشد باکتری به آنتی بیوتیک حساس می‌باشد.

آزمایش حساسیت به نووبیوسین، برای افتراق استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس از سایر استافیلوکوکوس‌های کوآگولاز منفی جدا شده از نمونه‌های ادرار به‌کار می‌رود. این ارگانیسم به آنتی بیوتیک نووبیوسین ۵ میکرو گرمی بر اساس روش CLSI  با هاله عدم رشد کمتر یا مساوی ۱۶ میلی متر مقاوم می‌باشد.

حساسیت گونه‌های استافیلوکوک به آنتی بیوتیک فورازولیدون ۱۰۰میکرو گرمی با قطر هاله عدم رشد مساوی یا بیش از ۱۵ میلی‌متر و مقاومت به آنتی بیوتیک باسیتراسین (0.04U) با قطر هاله عدم رشد کمتر از ۱۰ میلی‌متر (افتراق بین جنس‌های استافیلوکوک و میکروکوک)

حساسیت گونه‌های میکروکوک به آنتی بیوتیک باسیتراسین (0.04U) با قطر هاله عدم رشد مساوی یا بیش از ۱۰ میلی مترو مقاومت به آنتی بیوتیک فورازولیدون ۱۰۰میکرو گرمی با قطر هاله عدم رشد کمتر از ۱۵ میلی متر (افتراق بین جنس‌های میکروکوک و استافیلوکوک)

کلنی‌های میکروکوکوس لوتئوس (M.luteus) بر روی آگار خون دار ۵٪ تهیه شده با خون گوسفند، بدون همولیز با پیگمان  زرد روشن

استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بر روی آگار خون دار ۵٪ تهیه شده با خون گوسفند.

بیشتر گونه‌های استافیلوکوک کوآگولاز منفی بدون همولیز هستند. استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به آنتی بیوتیک پلی میکسین (300U) با قطر هالع عدم رشد کمتراز ۱۲ میلی‌متر مقاوم می باشد.

A. استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس (S.saprophyticus) با کلنی‌های سفید براق یا کرمی، غالباً از نمونه‌های ادراری زنان جوان که از نظر جنسی فعال هستند جدا می‌شود. 

B. این ارگانیسم به آنتی بیوتیک نووبیوسین ۵ میکرو گرمی بر اساس روش CLSI با هاله عدم رشد کمتریا مساوی ۱۶ میلی متر مقاوم است.

آزمایش کاتالاز، در این آزمایش پراکسید هیدروژن ۳٪ بر روی لام به کلنی باکتری اضافه می‌شود و یا کلنی باکتری با استفاده از سواب به قطره H₂O₂ اضافه می گردد. مثبت بودن آزمایش با ایجاد حباب‌های هوا مشخص می‌شود که در این صورت باکتری H₂O₂  را به اکسیژن و آب تجزیه کرده است. این آزمایش برای تشخیص استافیلوکوک‌ها و میکروکوک‌ها از سایر کوکسی‌های گرم مثبت هوازی به کار می‌رود. آزمایش کاتالاز در استافیلوکوک‌ها و میکرو کوک‌ها مثبت است

تخمیر گلوکوز در محیط اکسیداسیون و تخمیر (OF)

این آزمایش برای افتراق میان گونه‌های استافیلوکوک از گونه‌های میکروکوک به کار می‌رود. استافیلوکوک‌ها در محیط OF در شرایط بی‌هوازی که با لایه ای از روغن معدنی در سطح محیط ایجاد می‌شود، از گلوکوز اسید تولید می کنند و رنگ محیط را زرد می کنند (لوله آزمایش سمت چپ). این میکروارگانیسم همچنین گلوکوز را در شرایط هوازی مصرف می‌کند (لوله سمت راست).

اکسیداسیون گلوکوز در محیط اکسیداسیون و تخمیر (OF)

گونه‌های میکروکوک گلوکوز را اکسید می‌کنند (لوله آزمایش سمت راست که دارای شرایط هوازی است زرد رنگ شده است). اما کربوهیدرات را تخمیر نمی‌کنند (لوله آزمایش سمت چپ که دارای شرایط بی هوازی است و سبز رنگ باقی مانده است). واکنش اسیدی ایجاد شده توسط ارگانیسم اکسید کننده، ابتدا در سطح محیط خود را نشان می‌دهد و سپس در تمام محیط پخش می‌شود.

 آزمایش کوآگولاز روی لام شیشه ای، از سلول‌های یک کلنی جوان در سرم فیزیولوژی سوسپانسیون تهیه می‌شود. سپس یک قطره از آن را روی لام شیشه‌ای ریخته و یک قطره پلاسمای خرگوش به آن اضافه می‌گردد. اگر ارگانیسم دارای کوآگولاز متصل (فاکتور ایجاد لخته) باشد، آنزیم روی فیبرینوژن پلاسما اثر می‌کند و باعث چسبیدن باکتری‌ها می‌شود (شکل بالا). استافیلوکوکوس اورئوس را می‌توان به‌وسیله این آزمایش از دیگر گونه‌های استافیلوکوک تشخیص داد. برخی از استافیلوکوک‌ها نظیر استافیلوکوکوس لوگدوننسیس و استافیلوکوکوس شلیفری نیز این آنزیم را دارند. در این آزمایش کوآگولاز متصل به باکتری تشخیص داده می‌شود. 

آزمایش کوآگولاز لوله ای

در این آزمایش کوآگولاز آزاد تشخیص داده می‌شود. چند قطره از سوسپانسیون میکروبی را به پلاسمایی که به نسبت ۱:۱۰ در سرم فیزیولوژی رقیق شده اضافه کرده به مدت ۲ تا ۴ ساعت انکوبه می‌کنند و سپس با چرخاندن لوله به دو سمت ایجاد لخته بررسی می‌شود. کوآگولاز آزاد روی پروترومبین و فیبرینوژن پلاسمای خرگوش فعالیت می‌کند و لخته ی فیبرینی تشکیل می‌شود. استافیلوکوکوس اورئوس کوآگولاز مثبت می باشد. (لوله آزمایش بالا).

مانیتول سالت آگار

این محیط کشت برای افتراق استافیلوکوکوس اورئوس از سایر کوکسی‌های گرم مثبت کاتالاز مثبت به‌کار می رود. این محیط حاوی NaCl 7.5% است که از رشد بسیاری از میکرو ارگانیسم‌ها جلوگیری می کند. استافیلوکوکوس اورئوس در این محیط رشد می‌کند و با تخمیر مانیتول اسید ایجاد می‌کند. اسید ایجاد شده موجب تغییر رنگ معرف فنل رد و زرد شدن محیط می‌شود.

 استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بر روی مانیتول سالت آگار رشد کرده اما مانیتول را تخمیر نمی‌کند.

استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس بر روی مانیتول سالت آگار رشد کرده و مانیتول را تخمیر می‌کند. بعضی از سویه‌ها مانیتول را تخمیر می کنند.

میکروکوکوس لوتئوس بر روی مانیتول سالت آگار رشد کرده اما مانیتول را تخمیر نمی‌کند. رنگ زرد کلنی‌ها از ویژگی‌های ارگانیسم می‌باشد.

استافیلوکــوکوس سیتـرئــوس (S.citreus) بر روی مانیتول سالت آگار رشد کرده و مانیتول را تخمیر می کند.

آزمایش پیگمان، برای تشخیص باکتری‌های تولید کننده پیگمان به‌کار می‌رود. سواب کتانی را بر روی کلنی میکرو ارگانیسم زده، در صورتی‌که ارگانیسم پیگمان تولید کند رنگ آن بر روی سواب به‌جا می‌ماند.

آزمایش اورنیتین دکربوکسیلاز، برای افتراق استافیلوکوکس لوگدوننسیس از استافیلوکوکوس شلیفری به‌کار می‌‌رود، آزمایش استافیلوکوکس لوگدوننسیس مثبت است. محیط کشت حاوی ۱% اسید آمینه اورنیتین، گلوکز، پپتون و اندیکاتور pH (کروزول بنفش) و روغن معدنی استریل می‌باشد. ابتدا باکتری گلوکز را تخمیر کرده محیط را اسیدی کرده و رنگ محیط را از بنفش به زرد تبدیل می‌کند سپس تحت شرایط بی ‌ازی اسید آمینه اورنیتین را دِکربوکسیله کرده و آن را به پوتریسین تبدیل می‌کند و محیط را قلیایی کرده که مجدداً رنگ محیط بنفش (تست مثبت) می‌شود. در صورتی‌که باکتری آنزیم دکربوکسیلاز را نداشته باشد رنگ محیط زرد باقی‌می ماند.

سویه بتا همولیتیک بدون پیگمان. 

 A. برخی از سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس تولید پیگمان نمی‌کنند. 

B. سویه بتا همولیتیک با تولید پیگمان.

آزمایش نوکلئاز مقاوم به حرارت برای تشخیص استافیلوکوکوس اورئوس

در این محیط کشت تولوئیدن بلو همراه با DNA ترکیب شده و رنگ محیط را آبی می‌کند. ابتدا چند کلنی از باکتری مورد نظر را به ۱ میلی لیتر BHI  مایع اضافه کرده مدت دو ساعت در دمای ۳۵ درجه انکوبه می‌کنند. محلول را به مدت ۱۵ دقیقه در بن ماری جوش قرار می‌دهند. سپس پلیت را با پیپت پاستور سوراخ کرده و آگار آن را خارج کرده و در آن دو قطره سوسپانسیون سرد شده باکتری اضافه کرده به مدت ۲ ساعت اینکوبه می‌شود. تشکیل رنگ صورتی یا قرمز نشان دهنده مثبت بودن آزمایش است. علاوه بر استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس شلیفری نیز این آنزیم را تولید می کند. 

B. آزمایش نوکلئاز مقاوم به حرارت منفی

گونه‌ی استافیلوکوک با مقاومت نامتجانس به اکساسیلین

کلنی‌های رشد کرده استافیلوکوک‌ها در قسمت هاله عدم رشد دیسک اکساسیلین نشان دهنده سویه‌های با مقاومت نامتجانس بوده. این مقاومت ایجاد شده نتیجه به دست آوردن ژن A mec می‌باشد که یک پروتئین متصل به پنی سیلین را رمزدهی می کند. 

 اکساسیلین اسکرین پلیت، شامل ۶ میکروگرم در میلی‌لیتر اکساسیلین با ۴ درصد سدیم کلراید به‌عنوان مکمل در محیط مولر هینتون آگار می‌باشد. برای ردیابی سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (اکساسیلین) به‌کار می‌رود. رشد در قسمت تلقیح شده پس از ۲۴ ساعت در دمای 35ºC نشان دهنده وجود MRSA یا استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین می باشد و عدم رشد نشان دهنده حساسیت به این آنتی بیوتیک می‌باشد.

آزمایش تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی در استافیلوکوکوس اورئوس

اغلب سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به پنی سیلین مقاوم هستند. (دیسک قرار گرفته در موقعیت ساعت ۴).